Bước đầu tạo cây tiêu in Vitro kháng nấm Phytophthora sp.

ii
TÓM TẮT

ĐINH VŨ THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. “BƢỚC
ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp.”
Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH
Đề tài “Bƣớc đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm
Phytophthora sp.” đƣợc tiến hành giai đọan đầu là giai đoạn tạo ra cây tiêu trong phòng
thí nghiệm tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại
Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2006.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến
khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu
 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L
BA.
 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora
 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy
mô sẹo cây tiêu
Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vào môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu
với nhiều nồng độ dịch nấm khác nhau. (bảng bố trí thí nghiệm).
Thí nghiệm 2: Nhuộm mẩu mô sẹo
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm:
- Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng
chất cellulose pectic.
- Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất
gỗ (ligin) hay bần (suberin).





iii
Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng
nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
Phƣơng pháp
vô trùng
Nghiệm
thức
Nồng độ
dịch nấm (%)
Số
chai
Số mẫu/chai
Tổng số
mẫu
DC 0 15 2 30
Hấp khử trùng
CC 5 15 2 30
CB 10 15 2 30
CA 20 15 2 30
Lọc vô trùng
KC 5 15 2 30
KB 10 15 2 30
KA 20 15 2 30
Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5%
có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm
20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm
10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng.


















iv
MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ix
PHẦN 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Giới hạn đề tài 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu 3
2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 3
2.2.1 Thế giới 3
2.2.2 Việt Nam 4
2.2.2.1 Tình hình sản xuất 4
2.2.2.2 Tình hình tiêu thụ 7
2.3 Tình hình bệnh trên cây tiêu 8
2.3.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra 8
2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh 9
2.4 Giới thiệu về giống Phytophthora 9
2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10
2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 15
2.6.1 Sự hình thành mô sẹo 15
2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo 17
2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo 17

v
2.7.1 Auxin 17
2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin 18
2.7.1.2 Auxin trong cây trồng 18
2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp 19
2.7.2 Cytokinine 19
2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine 20
2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng 20
2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng
bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 20
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22
3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 22
3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng 22
3.2.2 Phòng cấy cây 22
3.2.3 Phòng cấy nấm 22
3.2.4 Phòng nuôi cây 23
3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm 23
3.3. Vật liệu nuôi cấy 23
3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 24
3.4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết
nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 24
3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 24
3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora 24
3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora
trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 25
3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo và xem kết quả dƣới kính hiển vi 27
3.5 Phân tích thống kê 27
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm
Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 28
4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 28

vi
4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong
môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 28
4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy 34
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
5.1 Kết luận 37
5.2 Kiến nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
MỤC LỤC 1 39
MỤC LỤC 2 40


















vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo
BA: Benzyladenine
2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid
MS: Murashige & Skoog
ctv: Cộng tác viên

















viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 5
Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) 6
Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu
hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế 7
Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ
1996 – 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) 7
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm
Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu 26
Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và
hệ số tăng trƣởng mô sẹo sau 90 ngày cấy 29
















ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Sự hình thành mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung
1mg/L 2,4D và 3mg/L BA 28
Hình 4.2: Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung
1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy 31
Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 31
Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 32
Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy 32
Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 33
Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 33
Hình 4.8 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L
2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy 34
Hình 4.9 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có
bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10) 35
Hình 4.10 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có
bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm sau 10 tuần
(độ phóng đại 4x10) 35

1

PHẦN 1. GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề
Cây hồ tiêu (Piper nigum L. ) là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó
mang lại nguồn thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình ở nƣớc ta. Hạt tiêu là một loại
gia vị đƣợc ƣa chuộng trên khắp thế giới. Hạt tiêu có vị cay, có mùi thơm là gia vị
không thể thiếu của nhiều món ăn. Ngoài ra tiêu còn đƣợc dùng trong công nghiệp chế
biến hƣơng liệu, nƣớc hoa và trong y dƣợc.
Việt Nam là một nƣớc có điều kiện khí hậu rất thuận lợi cho việc trồng và phát
triển cây hồ tiêu. Trong những năm gần đây diện tích trồng tiêu của nƣớc ta đã gia
tăng rất nhanh nhất là vùng miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Cùng với việc gia
tăng về diện tích là việc gia tăng về sản lƣợng xuất khẩu. Do đó, áp lực dịch bệnh ngày
càng gia tăng trong các vƣờn tiêu. Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm
Phytophthora gây ra thực sự là một tai họa cho nhà vƣờn ở các vùng tiêu nguyên liệu
lớn ở nƣớc ta. Bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thƣờng làm tiêu chết hạng loạt,
thiệt hại năng suất trầm trọng, vì vậy việc hạn chế thiệt hại do loại bệnh này gây ra là
một yêu cầu cấp thiết hiện nay.
Hiện nay trên thế giới chƣa có một dòng tiêu thƣơng mại nào có khả năng
kháng với nấm Phytophthora. Tuy nhiên, một vài dòng tiêu có khả năng chống chịu
với loại nấm này đã đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Malaysia và Indonesia.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ loại nấm này
nhƣng chƣa có biện pháp nào thực sự có hiệu quả và lâu dài. Ngƣời dân chủ yếu sử
dụng thuốc hóa học làm biện pháp chính để hạn chế bệnh nhƣng không có hiệu quả.
Sử dụng thuốc hóa học rất tốn kém và dẫn đến các tác hại đối với môi trƣờng. Các
nghiên cứu về biện pháp sử dụng nấm đối kháng vẫn chƣa thực sự có hiệu quả. Vì vậy
cần phải có những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora để làm
giảm thiệt hại do loại nấm này gây ra. Trƣớc những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi
quyết định thực hiện đề tài “Tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm
Phytophthora sp.” để tạo ra những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm
Phytophthora nhằm làm giảm thiệt hại của loài nấm này gây ra.
2

1.2 Mục đích
- Tạo cây tiêu có khả năng chống chịu nấm Phytophthora.
1.3 Yêu cầu
- Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vô trùng với nhiều nồng độ khác
nhau trên mô sẹo tiêu.
- Bƣớc đầu tạo ra nhiều cá thể sau đó thực hiện việc chọn lọc các cá thể có tính
kháng cao.
- Thực hiện nhuộm mẫu mô sẹo tiêu, xem hình thái để bƣớc đầu đánh giá ảnh
hƣởng của dịch nấm đối với sự phát triển của mô sẹo.
1.4 Giới hạn đề tài
Do giới hạn về thời gian nên đề tài chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo ra cây tiêu in vitro
trong phòng thí nghiệm.

Xem chi tiết: Bước đầu tạo cây tiêu in Vitro kháng nấm Phytophthora sp.