Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

v

SUMMARY

NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam.
Aug 2005.

ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms)
QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD

Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy.

Recently, GMO is a controversial problem in the world. Because its advantages and
disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its
affects to environment and human health. For this purpose, methods for GMOs
detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO
presentation in food and feed need to be developed. So, in this thesis, a process for
GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one
of the most exactly methods for GMO quantification now.
Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S
promoter by Real-Time PCR method. Evaluating quantification ability and efficiency
of method. Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in
Ho Chi Minh City.
Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method:
- Step 1: DNA extraction:
Cell wall destruction solution: CTAB 2%.
Protein denaturalization solution: phenol/chloroform.
DNA precipitation solution: Isopropanol
- Step 2: GM maize screening based on 35S promoter.
Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye.
Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86-
86,5
o
C).
- Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter.
Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman.
Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a
experiment template, exactly quantification a template which percentage
ratio of GMO presentation has known.
- Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO
in its ingredients.
Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been
established and can be applied to many other species.





vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC vi
CHỮ VIẾT TẮT xi
DANH MỤC HÌNH xii
DANH MỤC BẢNG xiv
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
1.Đặt vấn đề 1
2.Mục đích và yêu cầu 2
2.1.Mục đích 2
2.2.Yêu cầu 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) 3
2. Quá trình tạo sinh vật GMO 3
2.1.Quá trình cơ bản 3
2.2.Promoter CaMV 35S 4
3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen 6
3.1.Ứng dụng 6
3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] 6
3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17] 7
3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen 8
4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới 9
4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới 11
5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 12
5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] 12
5.2.Tác động có hại 12
5.2.1. Môi trường 13
5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng 13
5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể 14




vii

5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen 14
6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới 16
6.1.Quy định tại châu Âu [33]: 17
6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA 18
6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu 19
6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19
6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19
7. Tình hình Việt Nam 21
7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21
7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen 21
8. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen 22
8.1.Phương pháp ELISA 23
8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23
8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR 24
8.3.1. Hóa chất định lượng 24
8.3.1.1. SYBR Green I 25
8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) 25
8.3.2. Công cụ phát hiện 27
8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR 28
8.4.1. Quan hệ định lượng 28
8.4.2. Thiết kế thí nghiệm 29
8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30
8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO 31
8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen
[9][44]32
8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên
promoter 35S. 34
8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. 34
8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36
1.Nội dung nghiên cứu 36
2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 36




viii

2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm 36
2.2.Thời gian thực hiện 36
3.Tiến trình thí nghiệm: 36
4.Vật liệu thí nghiệm 37
5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA 38
5.1.Mục tiêu 38
5.2.Vật liệu 38
5.3.Phương pháp thực hiện 38
5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích 41
6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 41
6.1.Mục tiêu 41
6.2.Nguyên tắc 41
6.3.Vật liệu thí nghiệm 42
6.4.Trang thiết bị 42
6.5.Phương pháp thực hiện 43
6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR 43
6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại 43
6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại 44
6.5.4. Phân tích kết quả 45
7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen 46
7.1.Mục tiêu 46
7.2.Nguyên tắc 46
7.3.Vật liệu thí nghiệm 46
7.4.Trang thiết bị 46
7.5.Phương pháp thực hiện 46
7.5.1. Bố trí thí nghiệm 46
7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47
7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng 48
7.5.2. Thành phần phản ứng PCR 48
7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix 49
7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix 49
7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 49




ix

7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển 50
7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm 51
8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR.
54
8.1.Mục tiêu 54
8.2.Nguyên tắc 54
8.3.Vật liệu thí nghiệm 54
8.4.Trang thiết bị 54
8.5.Hóa chất 54
8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix 55
8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference
calibration DNA standards) 55
8.6.Phương pháp thực hiện 55
8.6.1. Bố trí thí nghiệm 56
8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng 56
8.6.1.2. Độ chính xác: 56
8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng 56
8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR 57
8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 57
8.6.5. Phân tích kết quả 58

9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58
9.1.Mục tiêu 58
9.2.Nguyên tắc 58
9.3.Vật liệu thí nghiệm 58
9.4.Trang thiết bị và hóa chất 58
9.5.Phương pháp thực hiện 59
9.5.1. Bố trí thí nghiệm 59
9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng 59
9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập 59
9.5.4. Phân tích kết quả 59
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60




x

1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA 60
2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 63
2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống 63
2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green 65
3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO 71
3.1.Xây dựng đường chuẩn: 71
3.2.Đánh giá kết quả định lượng 74
4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR
76
4.1.Độ nhạy của phương pháp: 76
4.2.Độ chính xác của phương pháp 78
5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85
1.Kết luận 85
2.Đề nghị 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO 87
PHỤ LỤC 92




xi

CHỮ VIẾT TẮT

35S: 35S promoter
Bp: Base pair
Bt: Bacillus thringensis
CaMV: Cauliflower mosaic virus
CCD: Charged coupled device
C
T
: Threshold cycle
CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates
EC: European Community
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
FAO: Food and Agriculture Organization
GMOs: Genetically modified organisms
GMP: Genetically modified plant
N/A: Not available
NTC: No template control
OD: Optical density
PCR : Polymerase chain reaction
QC-PCR : Quantitative competitive PCR
RNA: Ribonucleic acid
SD: Standard Deviation
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris,Acetic acid, EDTA
Taq : Thermus aquaticus
Tm : Melting Temperature
Tnos: Terminator nopaline synthetase
U: Unit
UV: Ultra violet




xii

DANH MỤC HÌNH

TRANG
Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17] 4
Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] 5
Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16] 5
Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17] 9
Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20] 10
Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] 10
Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19] 11
Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] 15
Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42] 19
Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] 19
Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13] 20
Hình 2.12 : QC-PCR 23
Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] 25
Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] 26
Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] 27
Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] 28
Hình 2.17: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14] 30
Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] 31
Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO [44] 34
Hình 3.1: Màn hình Melt Curve 45
Hình 3.2: Màn hình Edit Protocol 50
Hình 3.3: Màn hình Edit Plate Setup 51
Hình 3.4: Màn hình View Quantities/Identifiers 51
Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data 52
Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification 53
Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve 53
Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích 60
Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm 61
Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 64
Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng 65
Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm 66
Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng 67
Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm 67
Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp 71
Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S 72




xiii

Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1 73
Hình 4.11: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3 75
Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy 76
Hình 4.13: Đồ thị định lượng p35S của các mẫu thí nghiệm 78
Hình 4.14: Đường chuẩn phản ứng định lượng p35S 79
Hình 4.15: Đồ thị định lượng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm 79
Hình 4.16: Đường chuẩn phản ứng định lượng gen tham chiếu 79










xiv

DANH MỤC BẢNG

TRANG
Bảng 2.1: Một số giống bắp được cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) 11
Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen 17
Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm 38
Bảng 3.2: Các quy trình ly trích 39
Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31] 42
Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 42
Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 43
Bảng 3.6: Chương trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 43
Bảng 3.7: Phương pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 44
Bảng 3.8: Chương trình nhiệt phân tích Melt curve 44
Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] 47
Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 48
Bảng 3.11: Chương trình nhiệt của 2 phương pháp 49
Bảng 3.12: Lượng lý thuyết (Số lượng phân tử) của hai chuẩn 55
Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phương pháp Real-Time PCR 56
Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 57
Bảng 3.15: Chương trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman) 57
Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA 60
Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu 62
Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt 63
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 1 64
Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 65
Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc các mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 66
Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm 68
Bảng 4.8: So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trong thí nghiệm 2 69
Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phương pháp 71
Bảng 4.10: Các thông số xây dựng đường chuẩn 72
Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phương pháp trong thí nghiệm 3 74
Bảng 4.12: Kết quả định lượng mẫu 1 copy 77
Bảng 4.13: Kết quả định lượng mẫu Bt 176 1% 78
Bảng 4.14: Các thông số kết quả của thí nghiệm 80
Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm 81
Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu (C
T
Standard Deviation) 81
Bảng 4.17: Kết quả định lượng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại) 82

Xem chi tiết: Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR